层浪LongCyteTM 流式细胞仪用户项目分享
下面给大家介绍来自此用户的项目——精子碎片化检测
2023年,世界卫生组织(WHO)的一份报告显示,全球约有17.5%的适龄生育夫妇受不孕不育的困扰。根据国家统计局数据,我国不孕不育率约为12%-18%,其中男方原因占40%-50%左右,精子原因居首位。精子DNA碎片(Sperm DNA fragmentation, SDF)在男性不孕症中发生率较高,SDF常伴发少弱精子症,也可发生于常规精液指标正常的不育症患者。其发生机制包括精子成熟障碍、凋亡异常和氧化应激过高等。精子碎片化检测是精子检测中最重要的评估指标之一。
精子SDF的检测有很多方法,分为直接法和间接法,直接法有TUNEL、Coment、ISNT;间接法有SCSA、SCD、DBD-FISH。流式常用方法是SCSA(精子染色质结构分析)检测,与其他检测方法相比,流式细胞术可以在相对较短的时间内分析数千、数万个细胞,显著提高了SDF试验的可靠性。在SCSA检测中重要指标是精子DNA完整性(DFI),即精子DNA碎片率。DFI是指精子在形成过程中受到某些有害因素(如吸烟、高温、药物等)影响,发生DNA链断裂的精子占全部精子的百分比,使精子DNA完整性被破坏而产生断裂,DFI值越高则生育能力越低。
检测原理:
SCSA 被认为是检测精子 DNA 损伤的金标准。其原理是:受损的精子DNA 在酸的作用下变性形成单链,而正常精子DNA维持双链结构。吖啶橙( AO) 与双链 DNA结合发出绿色荧光,而与单链DNA结合发出红色荧光。发绿色荧光表示精子DNA完整,发红色荧光代表精子DNA呈碎片化。
样本准备(来自客户):
1. 样本在室温液化30-60min;
2. 将4℃保存试剂A液、B液、C1液和C2液取出,C2离心后,将C2全部转移至C1内配成染色液;
3. 检测管内加入精子样本10μL,加入 A液90μL,充分吹打混匀;
4. 加入B液200μL,计时30s;
5. 30s后时加入染色液600μL;
6. 染色完成1min后上机检测,建议检测在染色后40min之内完成。
(注:实验步骤不同试剂厂家有差异)
检测报告:
图1. 精子检测报告(LongCyteTM)
图示:Plot1,前散FSC和侧散SSC圈中主群;Plot2,去除碎片信号,圈精子细胞;Plot3,Green门为绿色荧光信号的精子细胞,Red门为已去除碎片的红色荧光信号的精子细胞,即Red门为DNA碎片化的精子细胞,高绿色荧光信号群(HDS)为MFI高于正常精子的信号。(注:Red检测通道ECD,620/30;Green检测通道FITC,530/30)
临床上除了精子碎片化检测以外;精子相关其他检测项目还有质膜完整性检测,线粒体膜染色、凋亡检测、活性氧检测、精子Ca2+ 水平检测、白细胞检测、顶体反应等。层浪流式细胞仪助力更多精子检测相关的研究和临床项目。层浪期望与更多生殖机构联手助力生殖检测发展。
参考资料:
[1] 倪吴花,AshokAgarwal,孙莹璞等,精子DNA 碎片检测的临床专家共识, 生殖医学杂志2023年2月第32卷第2期, 1004-3845.2023.02.002
[2] 精子碎片实验室检测与临床应用专家共识编写组,精子碎片实验室检测与临床应用专家共识———基于流式细胞精子染色质结构分析,中华男科学杂志 2022 年 2 月 第 28 卷 第 2 期。
[3] Flow cytometry and microscopic acridine orange test: relationship with standard semen analysis [J]. Reproductive BioMedicine Online, 2004, 8(4): 398-407.