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淋巴细胞转化试验方法介绍
点击次数:128 发布日期:2018-10-11  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

      T细胞在体外培养时,受到非特异性有丝分裂原(如PHA、ConA)或特异性抗原刺激后,可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞,此称为淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低,可以反映机体的细胞免疫水平,因此,可作为测定机体免疫功能的指标之一。
     本实验采用形态学方法进行淋巴细胞转化试验。T淋巴细胞在体外培养过程中受有丝分裂原如植物血凝素刺激后,转化为体积较大的母细胞,胞浆增多而深染,核增大并可见核仁裂,计数转化细胞的百分率可反映机体的细胞免疫功能。
【材料】
1.RPMLl640培养液(用前调至含小牛血清10%、青霉素100u/m1、链霉素μg/m1,用NaHCO3调pH至7.2-7.4)。
2.PHA(用RPMIl 640基础培养液配成1000μg/m1)。
3.吉姆萨染液。
4.离心机、恒温箱、计数器及显微镜等。
【方法】
1. 取无菌肝素抗凝血0.1m1,加入1.8m1细胞培养液中,同时加入PHA0.1m1,对照管不加PHA,将细胞置37℃、5%CO2培养3天,每天摇动1次。
2. 2500r/min,离心10min后弃上清液,留0.2m1沉淀细胞制片,迅速吹干。
3. 吉姆萨染色10一20min,水洗,干燥。
4. 油镜计数200个淋巴细胞中转化的细胞数,计算转化率。
【结果观察】
1.淋巴母细胞的形态学标准是细胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性及核的构造与
核仁的有无。可以见到以下几种类型细胞。
(1)成熟的小淋巴细胞:与未经培养的小淋巴细胞一样为6-8μm,核染色致密,无核仁,核与胞浆比例大,胞浆染色为轻度嗜碱性。
(2)过渡型淋巴细胞:比小淋巴细胞大,约l0-20μm,核染色致密,但出现核仁,此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。
(3)淋巴母细胞:细胞体积增大,约20-30μm,形态不整齐,常有小突出,核质染色疏松,有核仁l-2个,胞浆变宽,常出现胞浆空泡。
(4)其它细胞:如中性粒细胞在培养72h后,绝大部分衰变或死亡,呈碎片。
2.淋巴细胞转化率的计算:按上述分类检查推片头、体、尾三部分,计数200个淋巴细胞,计算过度型和淋巴母细胞百分率。在正常情况下,PHA诱导的淋巴细胞转化率为60%一80%,如为50%一60%则偏低,50%以下则为降低。
【注意事项】
1.培养基成分对转化率影响较大,注意其有效期。
2.小牛血清用前需灭活。
3.培养时要保证有足够的气体,
4.PHA剂量过大对细胞有毒性,PHA转化反应剂量一般10m1,培养瓶内液体总量不要超过2m1,太小不足以刺激淋巴细胞转化,试验前应先测定。

来源:上海研生实业有限公司
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