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知识分享:AAV在肺部的应用
点击次数:1420 发布日期:2018-6-12  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

腺相关病毒(AAV)属于依赖病毒属,细小病毒亚科,是一类自然缺陷的单链DNA病毒。野生型AAV基因组约4.7kb,含有rep和cap基因以及两端的ITR序列。尽管人类对AAV易感,但临床还并未发现与AAV相关的疾病。根据AAV衣壳蛋白基因的变异,可将AAV分为不同的血清型。不同血清型的AAV具有不同的组织特异性。将兴趣基因取代rep和cap基因构建一个两段带有ITR的载体,并将rep和cap置于一个独立的载体上,加上带有腺病毒辅助基因载体,便可包装出带有兴趣基因的重组腺相关病毒(rAAV)。

目前rAAV已被广泛作为基因转导载体使用,rAAV在人体实验中的安全性也已被证实。早在1996年,科学家们就选择肺作为rAAV的第一个靶向实验器官。下面我们旨在介绍rAAV在肺部实验中的启动子、血清型的选择,及其小鼠肺部的AAV注射方法。

  • 启动子的选择

根据不同的注射方式和实验目的,可选择不同的启动子以提高肺部表达效率。CMV在启动真核基因表达方面具有极高的效率,可高效感染小鼠肺部;CAG同样具有出色的感染气道的能力。

  • 血清型的选择研究表明,针对肺部感染rAAV在血清

研究表明,针对肺部感染rAAV在血清型上的选择根据动物模型的不同而存在差异,主要体现在小鼠及较低等灵长类动物与高等灵长类动物中之间。

 在小鼠及一些较低等的灵长类动物中,AAV5及AAV6是感染肺部的最佳选择。

血清型

感染表面

感染部位及水平

受体

rAAV2

基底层远大于表层

气道细胞:低水平或无

肺泡细胞:低水平或无

支气管上皮:低水平或无

气道平滑肌:中等水平

硫酸肝素(Heparin Sulfate)

rAAV5

基底层大于表面层

气道细胞:中等水平

肺泡细胞:中等水平

PDGFR,2-5联唾液酸受体

rAAV6

表层

气道细胞:中等水平

肺泡细胞:高等水平

支气管上皮:中等水平

气道平滑肌:低等水平

唾液酸糖蛋白

rAAV9

基底层和表层

气道细胞:低等水平

肺泡细胞:中等水平

半乳糖基葡聚糖

针对高等灵长类动物,AAV1对肺部的感染效率更高;而在肺癌的研究中,我们推荐AAV血清型选择如下:

 

种类

AAV血清型推荐

小鼠与低等灵长类动物肺部

AAV5/AAV6

高等灵长类动物肺部

AAV1

肺癌

AAV2(或慢病毒)

 

  • 小鼠肺部AAV注射方法

AAV感染肺部有多种方法,较为常用的方法为鼻内滴注、气管插管、气管内注射等。当对肺部感染AAV的特异性要求较低时,也可采用静脉注射的方法;当进行肺癌成瘤实验时,也可采用瘤内注射的方式。

 

在此,我们针对鼻内滴注、内镜辅助口腔气管插管术及气管内注射进行介绍。

  • 鼻内滴注法

鼻内滴注法是一种直接的AAV感染法,操作简单且对设备要求低,对新手实验员也同样适用。缺点是AAV颗粒容易沉积在上呼吸道(鼻道、鼻窦和咽)和胃肠道,如果需要有效地感染到下呼吸道,则可能需要更大剂量的AAV才能实现。

  • 腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪将小鼠麻醉;            

(动物必须处于足够深的麻醉状态以防止运动或对载体的反应而打喷嚏或咳嗽)

(2)将小鼠以背卧姿势固定在啮齿动物工作台上;

(3)将门牙环置于小鼠上门牙上,并将尼龙搭扣连接到啮齿动物工作台下表面的相应尼龙搭扣上;

(4)慢慢地将AAV悬液通过小鼠鼻孔内壁逐滴滴入,为保证最大地肺部感染效率,最小体积为50μL(每个鼻孔25μL),最大体积为75μL(每个鼻孔37.5μL)。待小鼠呼吸恢复正常后,再滴入一次75μL的AAV悬液;

(5)将小鼠轻轻从工作台拿下,并将头部和胸部用折叠的纸巾小幅度垫高,以保证小鼠顺畅的呼吸;           

(6)小鼠苏醒后,放回鼠笼。

  • 内镜辅助口腔气管插管术

口腔气管插管术能够将病毒载体直接灌输入肺中,却没有外科手术的风险,并且避免了上呼吸道的病毒颗粒的损失。由于几乎所有AAV病毒颗粒都会到达肺内,所以要严格控制AAV的使用量。同时,与鼻内滴注法相比,口腔气管插管术需要一些特殊设备,操作起来也稍有难度。

 

  • 腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪将小鼠麻醉;            

(动物必须处于足够深的麻醉状态以防止运动或对载体的反应而打喷嚏或咳嗽)

  • 将小鼠以背卧姿势固定在啮齿动物工作台上;
  • 将门牙环置于小鼠上门牙上,并将尼龙搭扣连接到             啮齿动物工作台下表面的相应尼龙搭扣上;
  • 小鼠的背部应完全平放在工作台上,胸部不应偏向两侧,并用尼龙扣完全固定;
  • 用尖头棉棒把小鼠的舌头卷起;
  • 轻轻地把附有耳镜的插管镜插入喉咙深部的气管开口处(大约在耳朵前部),插管镜的凹面应远离舌头;
  • 轻轻移动耳镜直到可以看到喉部(有时需稍微旋转镜子,以获得最佳视野);操作时需注意动作幅度要小,如果只能看到舌头背面,则需重新移出从头开始操作;
  • 当可以看清喉部时,便可加入一滴2%的利多卡因,在插管前,插管镜可移出(小于30s),在此期间要定位导管针;
  • 30秒以后,重复步骤(3)—(5),重新插入插管镜,重新找到可以看清喉部的位置;
  • 重新可以看清喉部后,导管针首先进入气管开口,针到位后,插管镜可以移出,然后引导导管缓缓向下,直到导管的中心(粉色部分)接触到小鼠门牙,每只小鼠不要尝试2次以上插入导管;
  • 一旦导管到位,要把针移出以便小鼠正常呼吸;
  • 确定导管在气管内的正确位置;
  • 用0.35mL的注射器通过导管按照3μL/g体重输入AAV;
  • 立刻使用1mL无针头注射器输入0.2mL空气,并重复2-3次以减少AAV在导管内的残留;
  • 把导管移出;
  • 将小鼠轻轻从工作台拿下,并将头部和胸部用折叠的纸巾小幅度垫高,以保证小鼠顺畅的呼吸;
  • 对小鼠状态进行监测直到其苏醒,预计在24到36小时之内会恢复轻到中度的呼吸。

 

  • 气管内注射

与鼻内滴注相比,气管内注射能够提高AAV进入肺部的效率;而与口腔气管插管法相比,设备更简单,操作更容易。与此同时,气管内注射具有极高的外科手术风险,包括出血、切口开裂、感染以及较长的恢复期等。不仅如此,由于小鼠气管窄小,也很容易出现失误,将AAV注射到气管周围组织或食管中去。

 

 

  • 腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪将小鼠麻醉;            

(动物必须处于足够深的麻醉状态以防止运动或对载体的反应而打喷嚏或咳嗽)

  • 将小鼠以背卧姿势固定在啮齿动物工作台上,固定好下巴和四支前端,并保证小鼠在45°斜面上,头略微抬高;
  • 去除小鼠颈腹侧的毛发(从喉咙至胸);
  • 使用湿润的纱布海绵清洗脱毛区域,再用含氯溶液擦拭皮肤,最后用70%酒精擦拭;
  • 在小鼠颈上部切一4mm左右切口;
  • 使用组织镊轻轻穿过皮下组织,找到颈部带状肌覆盖的气管;
  • 在带状肌上轻轻切口暴露气管;
  • 一旦可以看到气管,将针头斜面向上平行插入气管,针尖指向肺部,按照3μL/g体重输入AAV,然后将针拔出;
  • 将切口缝合或使用皮肤胶水粘合;
  • 将小鼠轻轻从工作台拿下,并将头部和胸部用折叠的纸巾小幅度垫高,以保证小鼠顺畅的呼吸;
  • 对小鼠状态进行监测直到其苏醒。
来源:山东维真生物科技有限公司
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