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MD应用文章下载:SNP基因分型高通量检测方法新思路
点击次数:1543 发布日期:2018-5-11  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

SNP基因分型高通量检测方法新思路

单核苷酸多态性
(single nucleotide polymorphism,
SNP),主要指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在,平均每500~1000个碱基对中就有1个,估计其总数可达300万个甚至更多。单核苷酸多态性是基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入。

近年来,单核苷酸多态性研究备受关注。由于个体间核苷酸序列存在很大差异,SNP的数量几乎是无限的,且每个SNP可能是潜在的有用标记。SNP标记的潜力已在人类基因分型中得到很好的展示。虽然此技术广泛应用于人类和动物基因组分析,但在植物上仍处于起步阶段,目前在水稻、玉米、大豆等作物研究中应用较多。研究表明,作物基因组序列均含有丰富的SNP,对其进行SNP研究,有利于揭示作物生长发育规律,而新的检测技术也促进了以SNP 为核心的高通量基因分型技术的发展,极大地推动了农作物在遗传、种质鉴定和功能基因的克隆与鉴定、分子育种等方面的研究。

随着SNP研究的日益增多,相关的检测技术也层出不穷,竞争性等位基因特异性
PCR(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP
)便是其中之一,可在广泛的基因组DNA 样品中(甚至是一些复杂基因组的DNA 样品),对SNP和特定位点上的插入、缺失进行精准的双等位基因判断,此方法利用2个荧光探针、2个通用淬灭探针,再加多个位点特异探针来检则多个SNP位点,原理上类似Taqman检测,也是基于终端荧光读取判断,每孔采用双色荧光检测一个样本的一个位点可能的两种基因型,但与Taqman技术不同的是,它不需要每个SNP位点都去合成特异的荧光引物,基于自己独特的ARM PCR原理,让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增,大大降低了KASP的试剂成本,比Taqman具有更好的位点适应性,所以在医学、农学检测方面都有非常好的应用

KASP
方法的样品一般可放于多孔板中如96孔板,非常适合在具有荧光检测功能的酶标仪上进行荧光信号的读取,以下便是在SpectraMax i3x和SpectraMax M5e酶标仪中读取KASP样品产生的荧光信号后所绘制的散点图:

 
       
上左图:FAM、HEX和两者的混合物的相对荧光强度与ROX进行标准化且标准化值在SoftMax Pro软件中绘制散点图。如图所示,得到了三个不同的集群。


上右图:ROX标准化的DNA扩增样品荧光在SoftMax Pro软件中绘制散点图。三个显著的集群被检测出来。FAM纯合子位置靠近X轴,而HEX纯合子则位置靠近Y轴,包含FAM和HEX的杂合样品所形成的的集群在两个纯合子集群之间。无模板对照形成的集群靠近坐标0点位置。所得数据与供应商验证试剂盒基因分型结果高度一致。

       
 

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