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通过四步轻松解决转印带来的麻烦
点击次数:181 发布日期:2017-12-5  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

在之前的一篇文章中,我谈到了弯曲条带,这是一个常见由于凝胶铸造和跑胶所引起的问题。 然而,虽然转印似乎是一个更简单的过程,但也很容易出错。 下面我将介绍几个有用的建议,让您无时无刻地检测到您的蛋白。

没有条带,意味着什么?

不幸的是,第一次你可能会认为你的转印没有起作用,当你在在暗室里成像时,没有条带(或者在实验室的生物成像仪前面,但是做出结果的可能性不大)

第一步—简单的转印检查

我们实验者多使用预染Marker,简单的转印效率检查是检查您的凝胶中是否有任何残留的染料。 你的Marker应该全部转移,如果没有,你的程序可能是错误的。 在这种情况下,尝试更长时间转印,冷凝装置转印和重新配置缓冲buffer。

如果你完全没有看到,那么检查你的转印的极性。 查看“三明治结构”是否有错误 如果可以,考虑对三明治设备进行颜色编码,并确保始终保持正确的极性。

第二步-详细的转印检查

如果您想要更多信息,那么简单的丽春红染色是验证您的转移的一个很好的步骤。 在转移后立即执行,这是检查您的泳道长度有效转移的好方法。 染色PVDF和硝酸纤维素膜很好,丽春红不适合染色尼龙膜。 再次,如果看到您的泳道长度转印不佳,并尝试更长时间,冷凝装置转印或重新配置转印buffer。

丽春红染色的膜显示出有效的蛋白质转移。 在大分子量和小分子量下的转移效力有所降低。

现在有更好的免染胶技术,免染凝胶技术在不使用分析试剂盒和荧光染料的条件下可在蛋白凝胶和s转印膜上检测到蛋白条带,免染凝胶含有三卤代化合物与蛋白中的色氨酸残基共价交联产生荧光产物。电泳之后,蛋白分离,使用 UV进行交联。UV 交联之后,产生的荧光能够被成像系统捕捉到,例如:Azure C 系列成像系统。免染技术不影响下游的检测,结果可用于样本的全蛋白定量(TPN),使用免染技术开展全蛋白定量,在抗体孵育之前印迹膜上的总蛋白可在成像系统中的 UV 模式下检测到。每个泳道的总蛋白量通过计算泳道内条带的荧光强度来确定的。抗体检测完成之后,每个泳道的目的蛋白被归一化到同一泳道的总蛋白中。

第三步-查看蛋白

如果您的蛋白分子量高(>120 kDa)或低(< 25 kDa)分子量,那么您应考虑更改转印条件。 对于大分子量蛋白,考虑增加转印时间,有时甚至可以过夜,但保持转印在冷环境是很重要的。 对于较小分子量的蛋白质,考虑减少转印时间并降低电压,以防止蛋白质完全通过膜。

对于大分子量蛋白,可能值得考虑使用低浓度的凝胶来容易地将蛋白质转印到膜中。 相反,小蛋白质容易离开凝胶透过膜,可以使用的孔径0.2μm的膜。

最后,您的转印缓冲液的组成可以对您的蛋白质移印和结合容易程度产生巨大的影响。 对于大分子量蛋白,SDS可以促进从凝胶转移到膜上,而甲醇促进蛋白和膜结合,但抑制转印。 因此可以考虑将甲醇稍微降至5-10%,并加入SDS至浓度为0.1%。 对于面临其他问题的非常小的蛋白,SDS应从转移缓冲液中消除,甲醇浓度提高到20%。

第四步-如果还没有条带?

在这一点上,熟练的人做转印,但仍然没有看到任何东西? 如果您正在使用非常低丰度的蛋白或品质不好的抗体,那么在这一点上,值得检查的东西应该被肯定地表达出来。

来源:北京深蓝云生物科技有限公司
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