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荧光定量PCR应用—病毒篇
点击次数:278 发布日期:2017-11-10  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

上篇已经介绍过荧光定量PCR原理及在肿瘤检测方面的应用,此篇将以三种病毒的检测来展现荧光定量PCR强大威力。

诺如病毒

    诺如病毒(Norovirus,NVs)属于杯状病毒科诺如病毒属,是引起非细菌性急性胃肠炎的主要病原体,世界50%以上的胃肠炎暴发均由它引起,可在医院、学校、餐馆等人群密集地爆发急性胃肠炎。

    根据病毒RNA 聚合酶和衣壳蛋白核苷酸序列的差异,诺如病毒分为5个基因型,其中GI、GII 型诺如病毒是世界范围内最常见的基因型。近年来,国内由诺如病毒引起的急性胃肠炎疫情的报道逐渐增多,日益成为重要的公共卫生问题。因此,建立快速、特异、灵敏的检测方法对该病的防控具有重要意义。

    检测诺如病毒的方法有电镜法、免疫法和分子生物学等方法,电镜法是最早的检测方法,但灵度低,而且样品处理过程复杂、技术要求高,不利于临床应用。免疫法应用比较多的是酶联免疫法,虽快速灵敏,但假阳性率高,检出率低。而以RT-PCR为主的分子生物学检测方法因准确、快速、特异性好、灵敏度高而被广泛应用,其中荧光定量RT-PCR方法不仅能定性检测诺如病毒,还能定量分析,这对于致病剂量和风险评估的后期研究有着重要的意义。

    有研究人员设计诺如病毒和副溶血性弧菌特异性引物,建立诺如病毒和副溶血性弧菌多重荧光定量PCR 检测方法,具有特异性强、灵敏度高、准确性好的特点,将能最大程度地避免死亡病原体的干扰以及排除非致病病原体的干扰。诺如病毒和副溶血性弧菌合检技术的建立,通过对全球传播范围最广、影响最大的2 种病原体的联合检测,有助于对肠道传染病检测技术的建立和深化,同时更加便利实验检测工作,为传染病早期诊断、控制疫情赢得宝贵时间,对食品安全检测、传染病暴发溯源和预警也将带来积极的作用。

    还有研究报道同时检测轮状病毒、GⅠ型诺如病毒和GⅡ型诺如病毒多重荧光PCR方法,而且该技术容易掌握,适合基础单位应用,也为突发性腹泻疾病暴发时病因的诊断提供了一个新的诊断方法。

乙肝病毒

    据估计,全球大约有3亿左右的乙肝病毒(HBV)携带者,我国是乙肝的高发区域之一。乙肝作为目前危害最为严重、流行性最广泛的病毒性肝炎,其早期诊治方法一直是临床研究的重点内容。

    乙肝出现的直接原因为乙型肝炎病毒感染,另外家族性传播、婴幼儿期感染病毒、缺乏预防意识、漏诊、既往有其他肝病史感染病毒等也是乙肝的主要发病原因。乙肝的传染源为乙型肝炎患者和乙型肝炎病毒携带者,乙肝的潜伏期为6 周~ 6 个月,乙型肝炎病毒的传播途径包括血和血液制品传播、母婴传播、性接触传播、经破损的皮肤黏膜传播,具有较强的传染性,感染乙型肝炎病毒后,受多种因素的影响,患者会出现不同的乙肝类型。

    乙肝患者若未得到及时、有效的治疗,会向肝纤维化、肝硬化、原发性肝癌进展,故此尽早诊断乙肝,有利于及时采取有效的治疗措施控制病情进展,控制传染源,促进预后效果的提高,临床意义重大。

乙肝病毒HBV的临床检测

    荧光定量PCR检测的是HBV本身的遗传物质—DNA,是病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度。另外,血清学指标(-)不能排除HBV感染,也可能出现血清学指标阳性,HBV-DNA(-);但也应注意到由于HBV-DNA检测低限的限制,因此临床上应将ELISA定性与PCR定量检测综合运用于乙肝病毒的临床检测中。

    近几年兴起的高灵敏荧光定量 PCR 技术,其检测下限远优于普通荧光定量 PCR 技术,检测下限可达到 20 IU/ml,普通荧光定量 PCR技术的检测下限一般为 500 IU/ml。高灵敏荧光定量 PCR 技术具有特异性高、灵敏度高以及结果得出速度快的优点,在检测乙肝病毒中可通过 DNA 体外扩增技术定量检测患者血清中的 HBV-DNA 病毒载量,对乙肝患者血液内病毒的复制情况进行明确,其还能有效反映 HBV 自身拷贝数、HBV 的感染和恢复情况,为临床治疗的效果、预后效果进行评价,有利于临床及时调整抗病毒治疗方案,促进临床治疗效果的提升。  

HBV-DNA定量检测的临床意义

治疗前:

  • 治疗前HBV低水平复制者对干扰素的反应性明显优于高水平复制者。
  • 治疗前HBV DNA 含量特别高者大多没有疗效。
  • HBsAg转阴的几乎都是那些治疗前血清HBV DNA 含量较低者。

治疗中:

  • 病毒复制水平迅速降低者,有望治愈。
  • 相反,治疗期间HBV DNA复制水平下降较慢,或下降幅度较小,或者变化不明显者,大多是干扰素治疗无效。

治疗后:

  • 治疗结束后,采用PCR定量法检测,HBV DNA <103 copy/ml 者,可能不再复发。
  • 终止治疗后HBV DNA 仍保持较低水平者,反跳的可能性较大。
  • 含量高者急性肝炎患者易慢性化,癌变的几率明显高于含量低者。
  • HBV-DNA定量检测还有助于指导怀孕与孕期,哺乳期检查;为肝脏移植提供数据支持;对血液制品和献血员的筛选等方面。

 

H7N9禽流感病毒

    禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)属于正黏病毒科A 型流感病毒属。根据其表面糖蛋白血凝(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的抗原性差异,分为16种HA和9种NA。野生水禽是禽流感病毒的自然宿主,一般对其是不致病的,当它们传染给其他物种时有时会造成大的发病率和死亡率,给人类和动物的健康带来巨大威胁。2013年中国首次报道人感染H7N9禽流感病毒的病例,截止2015年2月共有571例感染,212人死亡。H9N9 AIV 病毒是一种低致病性禽流感病毒,它引起家禽很轻微的或不引起临床症状,且很难在环境中检测。H7N9禽流感病毒的疫情防控比高致病性禽流感病毒H5N1难度更大,因此病毒的监测至关重要。

    实时荧光定量PCR方法是WHO推荐的H7N9定量检测方法,由于是直接检测病原体核酸,该方法具有高敏感,高特异和短检测窗口期等优点,为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。针对有些临床需要,除能够依据阴阳性判断确证病例以外还可以依据核酸的载量判断感染程度。

   但由于H7N9序列的突变,需要根据我国国情设计新的引物和探针序列。有研究设计的四重荧光定量PCR 方法能在1 个反应管里灵敏并特异地检测Flu A、H7、N9及RNase P,较WHO 推荐的方法,缩短了检测周期、显著简化了实验程序并降低实验费用。

    北京市研制的甲型H7N9流感病毒RNA检测试剂盒可在两个半小时内筛查出人是否感染H7N9病毒,将有效保障甲型H7N9流感病毒的防控工作。

    鉴于荧光定量PCR技术在病毒感染早期的快速检测,及预后效果评估方面的灵敏性和有效性,大量基于该技术的病毒检测试剂盒得到了很好的市场反馈,病毒检测试剂盒产品在食品安全、疾病预防控制和医疗等市场得到广泛应用。

 

来源:北京博康美华生物科技有限公司
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