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使用SpectraMax微孔板读板机检测Quant-iT PicoGreen dsDNA实验
点击次数:504 发布日期:2017-10-11  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

简介

双链DNA通常使用微孔板读板机通过测量DNA溶液的260nm吸收光进行定量。然而,这种方法通常在微孔板读板机上只能检测到最低250ng/mL的浓度。对于生物学应用涉及到小体积样品,如新一代测序和扩增产物定量时,更灵敏的方法才能满足需求。Life Technologies公司的Quant-iT PicoGreen dsDNA实验对于DNA的特异性更好且比传统的吸收光方法灵敏1000倍。产品信息中标称在微孔板上进行此实验,使用单一染料浓度时动态区间可达250pg/mL到1000ng/mL。1此篇应用文章展示使用Molecular Devices公司SpectraMax®荧光微孔板读板机和Quant-iT PicoGreen实验,用户能稳定的检测低至100pg/mL的双链DNA。

为了最大化实验的灵敏度,使用最优的激发和发射波长是必要的。不像基于滤色片的读板机,SpectraMax微孔板读板机的双光栅允许用户选择仪器标称范围内任意波长。确定能产生最佳实验动态区间的激发和发射波长是很重要的,因为这会与基于滤色片的读板机有一定区别。

SpectraMax M5荧光微孔板读板机的最优激发和发射波长如下:490nm激发和525nm发射,515nm发射截取滤色片(注意这些波长可能与Quant-iT PicoGreen产品说明书中针对基于滤色片读板机的波长有所不同)。SoftMax®Pro软件中有预设程序用来获取,展示和分析来自SpectraMax系列读板机的数据。

优势

- 灵敏的荧光定量低至 63 pg/mL的DNA
- 线性动态范围跨四个数量级
- 通过SoftMax Pro软件中预设的程序简单的分析结果

材料

- Quant-iT PicoGreen dsDNA实验试剂盒,包含l ambda DNA标准品(Life Technologies 货号 #P7589或P11496)
- 褐色96-孔板(Greiner Bio-One, 货号#655096)
- 棕色或琥珀色 (避光离心管)
- Molecular Devices 带荧光检测模式的微孔板读板机:
- S pectraMax® M3/M4/M5/M5e(cat. #M3 or #M4 or #M5 or M5E)
- SpectraMax® i3x (cat. #i3x)
- S pectraMax® M2/M2e(cat. #M2 or M2E)
- Gemini XPS/EM (cat. #XPS or EM)
- FlexStation® 3 (cat. #FLEX3)
- FilterMax F3/F5 (cat. #F3 or F5)
- S pectraMax® Paradigm(cat. #PARADIGM)
- SoftMax® Pro软件(Molecular Devices)

方法

仪器设置

- 将微孔板读板机开机。
- 启动SoftMax Pro软件并在Protocols下拉菜单中打开 PicoGreen荧光程序。 针对实验最优的设置已包含在程序中(见Table 1)。通过点击“Settings”并在屏幕左侧选择需要读取的孔并和实验板类型。
- 点击“Template”按钮来打开窗口,在窗口中您可以分配多孔板的孔到预设模板的相应组中。 可以使用下拉菜单来选择合适的模板组。荧光程序中有多个预设的模板组,包含Standards,Unknowns,和Unknowns_NoDiln (对应稀释的样品)。分配孔到当前模板的组中会将程序组表格中所对应的微孔板读取时获得的数据进行分组。

准备实验

实验方法遵循QuantiT PicoGreen dsDNA试剂和试剂盒中产品信息页中的指导,除了实验体积按比例从2.0mL减到200μL来适应96孔微孔板格式。

- 通过使用无DNA酶水20倍稀释试剂盒中的浓缩缓冲液制备1XTE缓冲液(10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH7.5)。
- 使用TE缓冲液(上面制备的)200倍稀释浓缩的Quant-iT PicoGreen试剂DMSO溶液来制备水相工作液。推荐在塑料容器中而不是在玻璃容器中制备此溶液,因为试剂有可能吸附在玻璃表面上。通过使用琥珀色或棕色管或用金属箔包裹将试剂避光。应在试剂制备后几小时内使用。
- DNA标准曲线:用TE缓冲液制备2μg/mLdsDNA储液。试剂盒中提供的ambdaDNA标准品可以通过使用TE稀释50倍来制成2μg/mL溶液。

注意:某些情况下可能需要使用和待测DNA相似的DNA类型制作标曲

- 高浓度范围标曲可以浓度从1 ng/mL制备到1 μg/mL,低浓度范围标曲可以从25 pg/mL制备到25 ng/mL。对于高浓度范围标曲,按Table 2中稀释方案稀释;对于低浓度范围标曲,40倍稀释2μg/mL溶液制备50 ng/mL溶液,参考Table 3中的稀释方案。 注意:此篇应用文档,使用了浓度从1 μg/mL到50pg/mL的一系列标曲。
- 用移液器将100 μL每孔标准品转移到一个黑色 96-孔微孔板中,最好3个重复。确保向孔中加TE(无DNA)来作为空白孔。
- 加100 μL每孔Quant-iT PicoGreen试剂水相工作液。通过涡旋或震板机室温避光混合2到5分钟。

读取微孔板

- 确保紫色板子适配器(如果您的读板机需要的话)放入微孔板读板机的板托中。
- 点击SoftMax Pro软件中的Read按钮。仪器会读取板子并且相对荧光单位会显示在程序的板子区块中。

分析数据

- 微孔板读取之后,相对荧光单位 (RFUs)会被显示在板子区块中。模板建立设定的组表格中的数据会被分析。一套有代表性的组表格中的数据,见Table 4结果区块。
- 模板中分配指定的标准品会在程序中标准曲线区块被自动拟合成曲线(并显示在标准品组表格中)。默认设置是线性曲线拟合,但是拟合宽范围标曲时可使用loglog曲线拟合。可在曲线图区曲线拟合下拉菜单中选择曲线拟合。

结果

使用Quant-iT PicoGreen dsDNA实验和SpectraMax? M5 微孔板读板机测定浓度从1μg/mL到50 pg/mL的DNA标准品(MolecularDevices 公司其他荧光微孔板读板机会得到相似结果)。SoftMax® Pro软件会对每组标准品重复自动化校准并计算平均RFU,标准偏差,和%CV。使用SoftMax Pro软件loglog曲线拟合方式拟合标准曲线 (见Figure 1.)使用96孔板微孔板格式观察到的灵敏度低至63 pg/mL并且标准检测限通过孔板三倍标准偏差值校准。这数值明显低于QuantiT PicoGreen实验产品说明书中标称的250 pg/mL。Figure 2展示了低浓度端标准曲线。整个标曲范围的线性都非常好。

结论

Quant-iT PicoGreen dsDNA 实验,当在使用SoftMax Pro软件的SpectraMax微孔板读板机上检测时,是一种对于双链DNA快速,灵敏的检测方法。SoftMax Pro软件的分析能力通过一种方便阅读,客户可定制的报告格式提供定量分析。软件中预设的程序使快速的实验设置成为可能。

Molecular Devices公司额外的解决方案

SoftMaxProGxP软件为必须展示符合FDA21CFRPart11的GLP/GMP客户提供额外的工具和特性。具有优化的硬件和软件验证工具来加速和简便化验证过程,使展示数据采集和分析的符合性更简单。

对于更高的通量要求,Molecular Devices的’StakMax®多孔板操作系统能整合SpectraMax读板机并可实现自动化处理20,40,或50个一批的微孔板。

对于需要检测极低水平的DNA的客户MolecularDevices提供Threshold®系统和Threshold总DNA实验试剂盒。Threshold系统能检测和定量皮克级污染物,污染物包括总DNA宿主细胞蛋白,牛源污染物(如BSA,IgG,胰岛素,铁传递蛋白),蛋白A和G,和任何能被抗体结合的独特的蛋白。

更多信息,请访问www.moleculardevices.com/home.html

参考

1.Molecular Probes Data Sheet MP 07581 (20 December 2005): Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits.

来源:美谷分子仪器(上海)有限公司
联系电话:400 820 3586
E-mail:info.china@moldev.com

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