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水产品中恩诺沙星药物残留检测的操作流程
点击次数:1807 发布日期:2016-12-27  来源:http://www.csy17.com/news1431.html

水产品中恩诺沙星药物残留检测仪的操作流程

恩诺沙星(Enrofloxacin)是一种化学合成的广谱抗菌药物,是氟喹诺酮类药物的代表产品,广泛应用于养殖、临床等各个领域。

该类药物的耐药性、残留毒性以及不良反应等的报道越来越多。

世界许多国家都针对该类药物制定了动物性食品中的最大残留限量标准。

恩诺沙星的检测一般采用色谱法作为确证性检测方法;近年来快速筛选检测的免疫分析方法引起越来越多的关注。

本研究旨在建立水产品中恩诺沙星残留的一步式ELISA快速检测方法,以进一步提高快速筛选检测效率。

通过对传统两步式间接竞争ELISA竞争反应模式、反应时间、洗涤时间等主要因素的优化改进,建立了恩诺沙星一步式间接竞争ELISA检测体系;利用不同的偶联方法,建立并优化了恩诺沙星酶标抗体的合成方法,并以所制备的酶标抗体为基础建立了标记抗体型一步式直接竞争ELISA检测模式,并进行了加标水产样品的检测验证。

需要的器材和试剂
4.1 仪器:CSY-E96S水产品药物残留检测仪、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平(感量0.01g)
4.2 微量移液器:单道20µl-200µl,100µl-1000µl、多道300µl
4.3 试剂:无水乙腈、正己烷、浓HCl

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知:
实验器具必须洁净并使用一次性吸头,以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液:
配液1:0.15M盐酸溶液
    取5ml浓盐酸,加入去离子水中定容到400ml。
配液2:样本提取液
    量取10ml 0.15M盐酸溶液(配液1)加入到90ml无水乙腈中混合均匀。
配液3:复溶液
    将5×复溶液用去离子水5倍稀释,用于样本的复溶,复溶液在4℃环境可保存一个月。

5.3 样本前处理步骤:

5.3.1 动物组织(鸡肉、猪肉、鱼、虾)处理方法
1)称2.0±0.05g 均质过的组织样本于50ml离心管中;
2)加入8ml样本提取液(配液2),振荡5分钟,室温4000转/分离心10分钟;
3)取2ml清澈上层有机相至洁净干燥的10ml玻璃试管中,50-60℃水浴氮气吹干;
4)加入1ml正己烷,振荡2分钟,再加1ml复溶液(配液3),振荡30秒,室温4000转/分离心5分钟;
5)去除上层正己烷,取下层水相50µl液体用于分析。
样本稀释倍数:2    检测下限:0.3ppb

5.3.2 蜂蜜处理方法
1)取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中,加6ml样本提取液(配液2),振荡5分钟,使其充分溶解;
2)加入3ml复溶液(配液3),加入11ml二氯甲烷,振荡5分钟,室温4000转/分,离心5分钟;
3)吸去上层,取下层有机相8ml至干燥溶器中,50-60℃水浴氮气吹干;
4)用1ml复溶工作液溶解干燥的残留物,再加入正己烷1ml混合30秒,室温3000转/分以上,离心5分钟;
5)去除上层取下层50µl液体用于分析。
样本稀释倍数:2    检测下限:0.4ppb

5.3.3 牛奶处理方法:
1)取25µl样本液与475µl复溶液(配液3)混合,振荡1分钟,使其充分溶解;
2)取50µl液体用于分析。
样本稀释倍数:20    检测下限:3ppb

5.3.4 奶粉处理方法:
1)称取0.5±0.02g均质物至10ml聚苯乙烯离心管中,加入5ml去离子水,振荡,使其充分溶解;
2)取100µl样本液与400µl复溶液(配液3)混合,振荡1分钟;
3)取50µl液体用于分析。
样本稀释倍数:50    检测下限:6ppb

5.3.5 鸡蛋处理方法:
1)称取1.0±0.02g均质物至10ml聚苯乙烯离心管中,加入5ml去离子水,振荡,使其充分溶解;
2)取100µl样本液与400µl复溶液(配液3)混合,振荡1分钟;
3)取50µl液体用于分析。
样本稀释倍数:30    检测下限:3ppb

6 酶联免疫试验步骤
将所需试剂从4℃冷藏环境中取出,置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解,每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架,将不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。
实验开始前,用去离子水将20×浓缩洗涤液按20倍稀释成工作洗涤液。

6.1 编    号:将样本和标准品对应微孔按序编号,每个样本和标准品做2孔平行,并记录标准孔和样本孔所在的位置。

6.2 加样反应:加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶标记物50µl/孔,再加入50µl/孔的抗体工作液,用盖板膜封板,轻轻振荡5秒混匀,25℃反应45分钟。

6.3 洗    涤:小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,用工作洗涤液250µl/孔充分洗涤5次,每次间隔30秒,用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)。

6.4 显    色:每孔加入底物液A 50µl,再加底物液B 50µl,轻轻振荡5秒混匀,25℃避光显色15分钟。

6.5 终    止:每孔加入终止液50µl,轻轻振荡混匀,终止反应。

6.6 测吸光值:用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值(建议用双波长450/630nm)。测定应在终止反应后10分钟内完成。

7 结果分析

7.1 百分吸光率的计算
    标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准液(0ppb)的吸光度值,再乘以100%,即
 百分吸光度值(%)=    A    ×100%
    A0    
A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值

7.2 标准曲线的绘制与计算
    以标准液百分吸光率为纵坐标,对应的标准液浓度(ppb)的对数为横坐标,绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中,从标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。
    若利用试剂盒专业分析软件进行计算,更便于大量样本的准确、快速分析。(欢迎来电索取)

8 注意事项

8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温(25℃)会导致所有标准的OD值偏低。

8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会出现标准曲线不成线性,重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

8.3 混合要均匀,洗板要彻底,在ELISA分析中的再现性,很大程度上取决于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育过程中,用盖板膜封住微孔板,避免光线照射。

8.5 不要使用过了有效期的试剂盒,不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

8.6 显色液若有任何颜色表明变质,应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位(A450nm< 0.5 )时,表示试剂可能变质。

8.7 反应终止液有腐蚀性,避免接触皮肤。

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水产品药物残留检测仪

 

来源:深圳市芬析仪器制造有限公司
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