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核酸检测中涉及PCR污染的预防和处理原则
点击次数:2720 发布日期:2016-10-17  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

 一、适用范围:

本原则适用于涉及PCR方法进行食品安全检测的实验室

本原则适用于PCR实验室污染的预防和处理。

二、污染来源:

(1)样品间的交叉污染:样品污染主要是由于样品在运输、储存、放置过程中处置不当造成的污染。样品核酸模板在提取过程中,由于操作不当也会导致样品间的污染。

(2)试剂的污染:由于操作不当,造成核酸提取、扩增过程中各相关试剂的污染。

(3)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染。极微量的PCR产物污染就可造成假阳性。最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染。操作时比较剧烈地摇动反应管、开盖、反复吹吸样液都可形成气溶胶而引起污染。

(4)克隆质粒的污染:在用克隆质粒作阳性对照时,有时会出现克隆质粒的污染。

(5)实验器具的污染:如移液器的污染等。

三、防止污染的方法:

  (1)合理的实验室分区。实验室内各工作区的实验用品,包括移液器等应专用。如有可能,应在装有紫外灯的层流式工作台(如生物安全柜、超净工作台)内,吸加PCR试剂,工作台内应放置PCR专业用的微量离心机、一次性手套、各量程的移液器和其他必须物品。

  (2)正确的实验操作:

   a.吸加PCR试剂和模板的操作应严格按要求进行,吸样要慢,尽量一次性完成,      忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染。

   b.实验的过程中应勤换手套,在进出不同区域或进行模板操作后,都应及时更换手套。

   c.装有PCR试剂的微量离心管在打开之前应先做瞬时离心(约10s),将管壁及管盖上的液体甩至管底部,从而减少污染手套或加样器的机会。开管动作要轻,以防管内液体溅出或形成气溶胶,造成污染。

   d.在同时进行多个PCR反应时,应制备主反应混合液,再分装至PCR反应管,最后添加样品核酸模板,以减少单个添加操作繁琐造成的污染。

(3)实验器具和试剂:

       a.实验室自己配置的试剂,如去离子水、缓冲液等,在使用之前均应高压灭菌或过滤除菌。

        b.分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装,以减少重复取样次数,并置于-20℃保存,适当时,最好做到专人专用。另外,PCR试剂、PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存,不应放于同一冰盒或冰箱。

       c.所有吸头、反应管等应一次性使用,使用之前,都应经过高压处理。若条件允许,最好使用带滤器的枪头。各工作区内的移液器要有标识,应固定使用用途,不能交叉使用。     

 (4)实验设计方面应遵循实验室内部质量控制的相关规定,实验中至少应:

   a.设置目标DNA阳性对照反应。对靶序列所作的适当的稀释工作应于实验前在实验室内别的位置进行,这样可防止将靶DNA的浓溶液带到实验室中专门进行PCR的位置。

   b. 设置PCR试剂阴性对照和目标DNA阴性对照反应。

四、分析污染原因:

(1)试剂污染:检测阴阳性对照反应结果。如果阴性对照反应结果为阳性,说明PCR反应体系中某一种或数种试剂被污染。若阳性对照反应为阴性,则说明PCR反应体系中存在抑制物质,或一种至数种PCR反应试剂失效。

(2)环境污染:在排除试剂污染的可能性之后,如果污染情况仍存在,则考虑可能为环境污染。常见的污染源可能为各种实验表面的污染,包括实验台面、仪器设备表面、各种开关或把手等:对于这些污染可用擦拭实验来查找可疑污染源。其步骤如下:

        a.用无菌水浸泡过的无菌棉签擦拭可疑污染源;

        b.0.1mL去离子水浸泡;

        c.取5μL做PCR实验;

        d.电泳检测结果。

如果经过上述追踪实验,仍不能查找到确切污染源,则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的。

五、污染处理:

   (1)环境污染:

     a.稀酸处理法:对可以器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡,使残余DNA脱嘌呤。

     b.紫外照射(UV)法:紫外波长(nm)一般选择254nm和300nm,照射30min即可。选择UV作为消除残留PCR产物污染时,要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布,UV照射仅对500bp以上长片段有效,对短片段效果不大。

     c.若可能是气溶胶污染,应该更换实验场所,若条件不允许,则重新设计新的引物(与原引物无相关性)。

(2)试剂污染:

      若经对照实验显示,为试剂造成的污染,应立即更换试剂。

来源:济南铭晟医疗器械有限公司
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