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C.B.S变性梯度凝胶电泳DGGE 应用原理及注意事项
点击次数:7251 发布日期:2014-7-3  来源:上海苑胜

原理:变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophresis,DGGE)是一种实用价值较高研究DNA突变的分析方法。本质是一类电泳(电泳定义:带电颗粒在电场作用下,向着与其电性相反的电极移动,称为电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。)
DGGE主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段。当电泳开始时,DNA在胶中的迁移率仅与分子大小有关,一旦DNA移动到某一点,达到该DNA变性浓度位置时, DNA双链开始分开,从而降低了DNA的迁移速率。由于不同的DNA片段具有的碱基组成不同,使得变性条件产生差异,在凝胶上形成不同的条带,从而可以区分DNA突变型和野生型,可以进一步进行基因突变的分析。

另外DGGE还可与PCR联合使用,利用此项技术可以准确鉴定出单碱基替换、移框突变和少于10个碱基的缺失突变。通常先用病人的基因组DNA或者是有突变个体的DNA进行PCR扩增,然后用DGGE进行分析。最早由DGGE筛查的人类基因是珠蛋白位点,以后又有很多位点被筛查,如生长因子Ⅷ基因、生长因子Ⅸ基因等。并且该法适用于大样本的筛查,对一些罕见突变型的筛查也十分有用。

PCR-DGGE的另一个作用是可分析突变组成即突变谱。主要是利用诱变剂体外诱变人类原始淋巴细胞株,使之生成大量的HPRT-突变体,然后进行PCR扩增,用DGGE分析。用定量PCR-DGGE方法还可以确定标本中某特异DNA序列的拷贝数。其原理是将已知拷贝数的内参照与标本中的靶基因共同扩增,然后DGGE分离两者的扩增产物,根据其比率可以确定标本中靶基因的拷贝数。



步骤:
一、制变性胶:梯度胶制胶生成器来制作变性胶。
1.配制溶液(试剂准备):
1. 40% Acrylamide/Bis(37.5:1)

Reagent Amount
Acrylamide 38.93g
Bis-acrylamide 1.07g
dH2O To 100.0 ml
2. 50× TAE Buffer
Reagent Amount Final Concentration
Tris base 242.0g 2 M
Acetic acid, glacial 57.1 ml 1 M
0.5 M EDTA, pH 8.0 100.0 ml 50 mM
dH2O To 1,000.0 ml  

Mix. Autoclave for 20-30 minutes. Store at room temperature.
3. 0% Denaturing Solution

  6% Gel 8% Gel  10% Gel 12% Gel
40% Acrylamide/Bis 15ml 20ml 25 ml 30 ml
50×TAE Buffer 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
dH2O 83 ml 78 ml 73 ml 68 ml
Total volume 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml

Degas for 10-15 minutes. Filter through a 0.45 u filter. Store at 4 ℃ in a brown bottle for approximately 1 month.
100% Denaturing Solution

  6% Gel 8% Gel 10% Gel 12% Gel
40% Acrylamide/Bis 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml
50×TAE Buffer 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
Formamide(deionized) 40 ml 40 ml 40 ml 40 ml
Urea 42 g 42 g 42 g  42 g
dH2O To 100 ml To 100 ml To 100 ml To 100 ml

Degas for 10-15 minutes. Filter through a 0.45 u filter. Store at 4 ℃ in a brown bottle for approximately 1 month. A 100% denaturant solution requires re-dissolving after storage. Place the bottle in a warm bath and stir for faster results.

4. For denaturing solutions less than 100%, use the volumes for acrylamide, TAE and water described above in the 100% Denaturing Solution. Use the amounts indicated below for urea and formamide

Denaturing Solution 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90%
Formamide(ml) 4 8 12 16 20 24 28 32 36
Urea(g) 4.2 8.4 12.6 16.8 21 25.2 29.4 33.6 37.8

5. 10% Ammonium Persulfate

Reagent Amount
Ammonium persulfate 0.1 g
dH2O 1.0 ml

Store at –20 ℃ for about a week.

6. 2× Gel Loading Dye

Reagent Amount Final Concentration
2% Bromophenol blue 0.25 ml 0.05%
2% Xylene cyanol 0.25 ml 0.05%
100% Glycerol 7.0 ml 70%
dH2O 2.5 ml  
Total volume 10.0 ml  

Store at room temperature.

7. 1× TAE Running Buffer

Reagent Amount
50× TAE buffer 140 ml
dH2O 6,860 ml
Total volume 7,000 ml
Denaturing gel Gel


8.

Reagent

Volume Reagent Volume
0%UF 具体根据需要的变性范围按比例计算,共12.5 ml ddH2O 3.9ml
100%UF 50× TAE 100 uL
APS 25 uL 40% Acrylamide 1 mL
TEMED 15 uL APS 10 uL
配制一个高浓度,一个低浓度,体积各12.5 mL,操作要迅速,配制时抽气和冰浴的必要性不大 TEMED 8 uL
现用现配

2.灌胶:
各取高低浓度两种变性剂12.5 mL,分别加入两个梯度生成器两个管槽中,高浓度加入右侧管槽,低浓度加入左侧管槽,再加入交联剂(先加APS,再加TEMED)。利用蠕动泵将溶液灌至凝胶盒里两块玻璃板之间,待溶液充满玻璃板后插入梳子,放置一段时间等溶液凝固成胶体。

二、跑电泳:DNA样品在变性胶体中移动
1.将足量的缓冲液加入至槽体内,预热到指定温度。
2.将凝固好的凝胶盒放入槽体内,开始点样,设定好电泳仪,进行跑电泳。

注意事项:
1.配置试剂时一定要用去离子水,制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净,以防止氯离子污染。
2.制胶是实验的关键。在往玻璃板中灌胶时,要利用好蠕动泵,将凝胶液匀速地灌入玻璃板。
3.灌完胶后,立刻清洗注射器,以防丙烯酰胺凝固,堵塞管子。
4.DGGE 的电泳缓冲液要超过“RUN”刻度线,不要超过“Maximam”刻度线。
5.点样时,要用小型注射器,伸入点样孔底部点样。
6.每次用完仪器后要及时清理,清洗玻璃板培养皿等玻璃仪器。

结合以下配置对应图,了解以下配置的功能:
1.槽体是用来加入缓冲液,提供电泳的环境。
2.电泳仪是用来给电泳供电,设置时间。
3.凝胶盒是用来固定玻璃板,一块放入槽体内。
4.安全盖可用户自动断电保护。
5.加热器/搅拌器/缓冲液循环器是用来加热控制温度,保持温度的均一性。
6.玻璃板,封边胶条,封边垫条,弹簧夹,蠕动泵以及梯度生成器一并组成灌胶装置。
7.梳子插入到灌好的胶上层待其凝固后拔出,可产生点样口。
8.虹吸泵可轻松将槽体内的缓冲液排出吸进。
9.温度计用来校准温度。

CBS DGGE配置对应图解:
标配:2-Place DGGE System (DGGEK-2001-220)
1. 1 reinforced buffer tank/lower reservoir with platinum electrodes and attached anode power lead      槽体 
2. EPS-300-II Power Supply (see page 26)   电泳仪
3. 2 single gel cassette/upper reservoir with platinum electrodes 两个单面凝胶盒
4. Glass safety cover with electrical interlock   带电子安全锁的安全盖
5. Heater/Stirrer/Buffer Cycler: Heating element and thermostat maintain excellent temperature stability (±0.2°) and minimize thermal stratification during DGGE.Buffer Cycler eliminates need of an external peristaltic pump to recycle buffer  加热器/搅拌器/缓冲液循环器
6. 4 sets of spacers (2 sets for vertical DGGE and 2 sets with injection ports for perpendicular DGGE gel casting)      封边垫条
7. 4 combs (2 each 1-well combs and 2 each 16-rectangular well combs)    电泳梳
8. Buffer siphon pump     虹吸泵
9. 2 sets of glass plates     玻璃板
10. MPP-100 Mini-peristaltic pump for gradient gel formation    梯度胶制胶时用的蠕动泵
11. GM-40 Gradient maker, 20mls per side  梯度胶制胶生成器
12. 4 Gel Wrap® gaskets  封边胶条
13. White spring clamps  弹簧夹
14. Thermometer        温度计

上海苑胜全国独家代理产品,更多电泳型号请参考:http://www.360instrument.cn/chem/cbs/

来源:上海苑胜仪器设备有限公司
联系电话:021-60740207/020-82323205/010-63712599
E-mail:deng_yanqiong@springsci.com

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