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组织匀浆的制备方法
点击次数:6129 发布日期:2012-2-20  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
1、取组织块(0.2g~1g)最少可到2~5mg,在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,放入5或10ml的小烧杯内
 
2、用移液管量取预冷的匀浆介质(ph7.4,0.01mol/L Tris-HCL, 0.0001MOL/LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖0.8%的氯化钠溶液)或者用0.86%冷生理盐水,匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍,用移液管或移液器取总量的2/3的匀浆介质或生理盐水于烧杯中,用眼科小剪尽快剪碎组织块(天然时操作要在冰水浴中进行,将盛有组织的小烧杯放入冰水中)。

3、匀浆的方式有多种:手工匀浆、机器匀浆、超声匀浆、反复冻融。
手工匀浆:将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块,一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(6~8分钟),充分研碎,使组织匀浆化。

机器匀浆:用组织研磨机(OMNIBead Ruptor 24 多样品研磨珠均质仪) 6m/s研磨制成10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(Omni Prep 多样品均质仪 )匀浆时间20秒/次,间隙10秒,连续3-5次。
超声粉碎:用超声波细胞破碎仪(OMNI Sonic Ruptor400W)进行破碎,可用以振幅12.7mm超声处理30秒使细胞破碎.
反复冻融:培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆,也可以反复冻溶3次左右(即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰,溶解,再结冰,再溶解,反复3次左右),但有部分酶活力会受影响。
取少量组织匀浆做涂片(直接涂片、染色均可),显微镜下观察细胞是否磨破,若没有破则可以延长匀浆时间或增加冻融次数。

4、将制备好的10%匀浆用普通离心机或低温低速离心机3000r/min左右离心10~15分钟,若检测ATP酶,则只需要1000转/分,离心5分钟,将离心好的匀浆留下上清弃下面沉淀。
根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种测定。
 
本实验方案采用Omni的Bead Ruptor 24 多样品研磨珠均质仪和Prep 多样品均质仪(由北京平利洋公司提供)。
来源:北京平利洋经贸有限公司
联系电话:13581963618
E-mail:pingliyang2018@163.com

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