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新型冠状病毒病原学检测假阴性的产生原因及高效检测方法分析
点击次数:353 发布日期:2020-2-11  来源:TIANGEN
自2020年开始,新型冠状病毒肺炎的疫情就一直牵动着亿万人的心。截至2月11日8:29,全国已确诊病例累计42708例,疑似21675例,疫情防控形势依然严峻。
 
新型冠状病毒传播方式多样,除了经呼吸道飞沫和接触传播的主要途径外,目前已有报道病毒还可以经由气溶胶、消化道、母婴等不同方式传播,传播渠道多,传染力强。因此,控制nCov病毒传播比SARS等以往冠状病毒传播更加困难,也是目前感染率居高不下的重要原因之一,早发现,早隔离,早确诊,早治疗是本次疫情防控的重中之重。
 
根据国家发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(第五版)》,“疑似”和“确诊”的含义是:
 
 
由此可见,除了及早发现临床表现异常之外,及早从病原学确诊更是疫情防控的重要一环。快速确诊不但可以尽早对病人施以对症的治疗方法和药物、增加病人存活率,更可以减少医疗物资的使用量,提高医疗效率,更有力的控制疫情。
 
新型冠状病毒病原学检测
对于病原学检测,虽然有研究表明CRISPR和免疫方法也可用于病毒检测,但荧光RT-PCR和基因测序目前仍是唯二被认可的方法。两者相比,前者无疑有更大的优势,通常在1小时内即可检测接近几十甚至几百个核酸样本。所以,当前诸多医院和医检所均采用RT-qPCR的方法,使用官方公布的引物和探针,检测nCov的N1,N2,N3三个靶标基因检测和人类RNase P,通过阴性对照、阳性对照和目的基因的Ct值判断标本中是否含有nCov病毒(Real-Time RT-PCR Panel for Detection 2019-Novel Coronavirus, www.cdc.gov)。
 
另一方面,确诊除了需要速度,更需要精度,要在最大程度避免假阴性的产生。假阴性不但会造成对个体的错误判断,延误病情,更有可能造成传染源的遗漏,造成更大规模的传染。假阴性的产生原因主要有以下几点:
1. 样本采集不当,并未采集到合理位置的标本,病毒含量不能反映真实状况。
2. 样本保存和处理不当,造成处理过程中病毒RNA降解。
3. 提取效率低,病毒并未完全提取,或提取过程中病毒降解。
4. 检测分辨率低,检测下限过高,导致无法检出病毒。
5. 实验员操作不当。
由此可见,无论是RT-qPCR检测步骤,还是检测之前的病毒核酸提取的步骤,都要最大程度的避免产生假阴性。
 
样本准备
标准的样本类型,规范的样本采集、处理和运输,是避免假阴性的第一步。虽然已有报道病毒会通过粪口等其他方式传播,但目前世界卫生组织(WHO)的最新资料表明,呼吸材料(鼻咽和口拭子、痰液、肺泡灌洗液等)和血清样本是检测nCov的标准。WHO给出的临时指导中,样本类型、采集和储运的方式如下(Laboratory testing for 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) in suspected human cases):
 
 
核酸提取
在核酸提取层面,避免假阴性最重要的就是要提高核酸的得率。提高得率的难点有三:1. 上述样本不属于培养细胞等简单医疗样本,样本类型多,成分复杂,杂质含量高,对样本裂解效率有很大影响。2. 病毒含量较低,相应的对提取效率的要求就很高,要求提取得率尽量高,能够满足后续检测的要求。3. 样本中RNA酶会在提取过程中导致病毒RNA降解。因此,在提取时需选用得率高、纯度高的试剂盒。此外,在提取过程中,对操作人员的要求也比较高,在提取之前应进行整体培训,避免操作错误或引入RNA酶等杂质。
 
定量检测
获取核酸之后,RT-qPCR检测nCov病毒核酸也有需要注意的几点:1. 尽量提高检测分辨率,能够检出低丰度的核酸模板,避免假阴性。2. 尽量提高检测的准确率,避免非特异性信号造成假阳性。3. 尽量提高检测稳定性,对于同一核酸样本的检测结果平行性好。此外,定量实验的速度也是整体病毒检测速度中的决定因素,应选择操作简便、速度快的试剂盒进行检测。
 
天根生化科技(北京)有限公司作为中国核酸提取和检测试剂上游供应的领军企业,多次为国家病毒性流行病(如手足口病毒、甲型H1N1流感病毒、非洲猪瘟病毒疫情等)的诊断及预防提供帮助。目前天根生化正在持续为全国三十多家检测单位提供病毒核酸提取、荧光定量检测试剂以及相关仪器设备。
 
病毒基因组 RNA 提取试剂盒 (DP315-R)
 
 
DP315-R拥有独特的裂解液RL,能够应对冠状病毒检测的各类样本:血液、血清/血浆、组织、拭子、病毒等,裂解效率高,抗逆性强,还含有保护成分,避免RNA降解。试剂盒中特别配备了Carrier RNA用于充分收集微量RNA,提取得率高,最大限度的捕获病毒核酸。此外,离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料,高效、专一吸附RNA,可最大限度去除杂质蛋白等,提高收集的核酸纯度。
 
• 高效率:快速纯化得到高质量病毒RNA,重复性高
• 高得率:Carrier RNA收集微量核酸,提取灵敏度高,得率高
• 高纯度:完全抵抗和去除污染物和抑制剂,方便下游应用
• 高安全性:无有机试剂抽提或乙醇沉淀
 
 
探针法一步反转录-荧光定量试剂盒 (FP314)
 
 
FP314特别为检测样本中的微量基因和微量RNA病毒设计。试剂盒集成了反转录和荧光定量模块,一步完成从反转录到定量的全部操作,操作简单、快速。试剂盒中使用的King反转录酶和新型抗体修饰的Taq聚合酶均为新型工程酶,模板识别灵敏度高,抗逆性强,特别适合复杂环境中低丰度RNA模板的检测。本试剂盒是基于探针法设计,配合官方公布的引物和探针,对nCov病毒核酸的检测具有极高的准确率。
 
• 高效:性能优良的逆转录酶和DNA聚合酶保证了极高的反应效率
• 灵敏:低至1 ng 的模板也能被准确识别,特别适合低丰度模板
• 抗逆:通读GC含量高,二级结构复杂的RNA模板
• 普适:对不同物种来源及杂质较多的RNA模板的适用性高
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来源:天根生化科技(北京)有限公司
联系电话:免费咨询800-990-6057,订货010-59822604,59822688
E-mail:yan.lu@tiangen.com

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