抑制素B（Inhibin B）ELISA检测试剂盒使用说明书
更新日期：2004.10.18
[用途]
本试剂盒用于定量测定人血清中抑制素B（Inhibin B）的含量。
[临床意义]
抑制素是一种由女性卵巢颗粒细胞及男性睾丸支持细胞分泌的异二聚体蛋白质激素。它选择性抑制卵泡刺激素（FSH）的分泌，对性腺也有局部旁分泌作用。完整的抑制素分子是一个分子量约为32KD的分子，由两个不同的亚单位（a亚单位和b亚单位）经二硫键连接而成。卵泡液和血清中也可以发现a亚单位。此外，游离的a亚单位与b亚单位没有生物活性。
抑制素B由a亚单位和bB亚单位组成。抑制素B的主要作用是通过对FSH的负反馈作用调节配子发育。几种已发表的报告均表明，抑制素B可作为一种内分泌标记物，通过对它的检测，可以监测男性或女性的性腺功能。
DSL的二聚体抑制素B ELISA使用一对高度特异的抗体，仅与有功能的抑制素B分子特异性结合，不检测体液中的游离a亚单位。
[检测原理]
DSL-10-84100 ACTIVE® Inhibin B ELISA试剂盒使用酶增强“双位点”“两步”双抗体夹心免疫测定法。在实验中，标准品、质控及待测血清样本都在包被有抗抑制素bB亚单位抗体的微孔板中孵育。孵育及洗板之后，所有孔都加入生物素标记的抗抑制素a亚单位的检测抗体。再孵育及洗板之后，所有孔加入链霉和素-辣根过氧化物酶结合物。第三次孵育及洗板之后，加入TMB底物孵育。之后加入终止液，最后用双波长、在450nm及620nm处测吸光度。
测得的吸光度与抑制素B的浓度成正比。标准品用于描绘吸光度的标准曲线，待测抑制素B的浓度可从此曲线中读出。
[试剂组成]
1. 包被有抗抑制素bB亚单位抗体的微孔板（Anti-Inhibin B-Coated Microtitration Strips）：
96孔，2-8ºC下密封保存。
2. 标准品A/样本稀释液（Inhibin B Standard A/Sample Diluent）：
2ml×1瓶，胎牛血清，含0pg/mL二聚体抑制素B。使用前2-8ºC下保存。打开后2-8ºC下可保存2周。于-20ºC可长期保存。
3. 标准品B-G（Inhibin B Standards B-G）：
1ml×6瓶，胎牛血清，含二聚体抑制素B的浓度为10, 30, 100, 250, 500, 1000pg/mL。使用前2-8ºC下保存。打开后2-8ºC下可保存2周。于-20ºC可长期保存。
4. 质控（Inhibin B Controls）：
1ml×2瓶，浓度I、II，胎牛血清，含低浓度和高浓度的抑制素A二聚体。使用前2-8ºC下保存。打开后2-8ºC下可保存2周。于-20ºC可长期保存。
5. 样本稀释液A（Inhibin B Sample Buffer A）：
10ml×1瓶，2-8ºC下保存。
6. 样本稀释液B（Inhibin B Sample Buffer B）：
10ml×1瓶，2-8ºC下保存。
7. 抗体-生物素结合物（Inhibin B Antibody-Biotin Conjugate）（即用型）：
10ml×1瓶，含生物素标记的抗抑制素a亚单位抗体。2-8ºC下保存。
8. 酶结合物（浓缩）（Streptavidin-Enzyme Conjugate）（即用型）：
10ml×1瓶，含链霉和素-辣根过氧化物酶结合物。2-8ºC下保存。
9. TMB底物溶液（TMB Chromogen Solution）：
15ml×1瓶，2-8ºC下保存。
10. 终止液（Stopping Solution）：
15ml×1瓶，为0.2 M的硫酸。2-8ºC下保存。
11. 浓缩洗液（Wash Concentrate）：
100ml×1瓶，2-8ºC下保存。
[样本收集及保存]
使用血清样本，静脉穿刺术采集血液。样本于2-8ºC可保存24小时，-20ºC或以下可保存30天。避免反复冻融样本。不应采用溶血或脂血的样本。冰冻的样本在实验前应解冻，并充分混匀。
[试剂准备]
1. 洗液：在100ml浓缩洗液中加入900ml去离子水稀释。室温密封情况下可保存1个月。
2. 微孔板：选择实验所需的板条数。剩余不用的部分随同干燥剂密封放回原袋。
[操作步骤]
操作前所有试剂都应平衡至室温(~25ºC)并充分混匀。标准品、质控及待测样本需同时做双份。
1. 取出实验所需板条，并记录各孔位置。
2. 在对应的孔中加入标准品、质控及待测样本各50ul。
3. 每孔加入25ul样本稀释液A。
4. 每孔加入25ul样本稀释液B。
5. 封板，以300-400 rpm速度震荡，室温下过夜（14-18小时）。
6. 洗板3次，在吸水纸上拍干。
7. 每孔加入50ul抗体-生物素结合物。
8. 封板，以500-700 rpm速度震荡，室温下孵育1.5小时。
9. 洗板6次，在吸水纸上拍干。
10. 每孔加入50ul链霉和素-辣根过氧化物酶结合物。
11. 封板，以500-700 rpm速度震荡，室温下孵育20分钟。
12. 洗板6次，洗完最后一次以后，将洗液在孔内停留15分钟再除去。在吸水纸上拍干。
13. 在每孔中加入100ul TMB底物溶液。
14. 以500-700 rpm速度震荡，室温下避光孵育15-30分钟。
15. 每孔加入100ul终止液。
16. 30分钟内在450nm处读数。
注：必须以零标准作空白。如果能做到双波长测定，可在600或620nm处读数，将600（620）nm吸收值从450nm处减去，这样可以减少光学误差。
[结果计算]
1. 计算标准品、质控、待测样本的平均吸光度。
2. 使用数据缩减软件，用线/线或对数/对数图分析，根据各不同浓度标准品，以浓度（pg/ml）为X轴，所测得的吸光度为Y轴作标准曲线。通过双孔数据的平均值描绘最佳曲线。
3. 在标准曲线上，按质控及待测样本各自的平均吸光度找到相对应的浓度。
4. 超过曲线最高浓度的样本应经过0 pg/ml的标准品适当稀释后重新实验。
5. 低于曲线最低浓度的样本应如实报告。
6. 经过稀释的值需乘以相应的稀释倍数。如果样本的吸光度超出了标准曲线的范围，则此样本可在405nm处第二次读数，再作一条新的标准曲线（方法同上，如能做到双波长测定，则设置600或620nm为双波长值），取值。
[灵敏度]
理论的灵敏度或最小检测值为7 pg/mL。
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