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细菌基因组DNA快速提取试剂盒
细菌基因组DNA快速提取试剂盒
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国产/进口:国产半年访问:18
产地/品牌:东盛产品类别:分子生物学试剂
规       格:50次/100次最后更新:2018-7-31
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规格

价格

N1151

50次

485

N1152

100次

875

产品组分

组分

货号

N1151

N1152

消化缓冲液DS

15 ml

30 ml

裂解液MS

20 ml

40 ml

蛋白酶K

1 ml

2 ml

去蛋白液PS

30 ml

60 ml

漂洗液PE

15 ml

30 ml

纯化液TE

5 ml

10 ml

DNA纯化柱

 50个

 100个

说明书

1份

1份

注: 裂解液MS中含有变性剂,请不要直接接触皮肤。

  漂洗液PE初次使用前用无水乙醇按1: 3稀释,即含75%乙醇。

保存条件

蛋白酶K于-20℃保存,其余试剂置于室温(15-25℃)干燥条件下保存1年。

消化缓冲液如DS和MS有沉淀,在55℃加热溶解,待恢复室温后混匀即可使用。不会影响基因组DNA纯化效率。

产品说明

   本产品用于细菌基因组DNA的小量提取。其纯化原理是利用细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA,由硅胶膜柱可逆吸附基因组DNA,经蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白质、脂质等杂质后,用纯化液洗脱获得基因组DNA。本产品可从0.5-2 ml对数生长期的菌液(不超过106–108 个)中提取到3-20μg 超纯基因组DNA(OD260/280 = 1.7-1.9),此基因组DNA可直接用于酶切、PCR等后续实验。

产品特点

  • 高效:一次可获得3-20 μg基因组DNA。
  • 快速:30min内即可获得超纯的基因组DNA。
  • 安全: 整个操作中不用酚/氯仿有机物。
  • 高纯度:无须再纯化即可直接用于下游实验。

产品用途

  • 常规限制性酶切
  • PCR扩增
  • 文库构建
  • Southern 杂交
  • 分子标记分析

质量控制

纯化的基因组DNA质量通过限制性酶切和单拷基因的PCR扩增鉴定。

细菌基因组DNA提取流程图

图1  细菌基因组DNA纯化流程图

操作方法

 1  取0.5-2 ml处于对数生长期菌液,置于1.5 ml离心管中。12,000 rpm离心1min,弃上清。

 2  向收集到的菌体沉淀中加入200 μl 缓冲液DS,用漩涡振荡器剧烈振荡直至菌体彻底悬浮。

 注:对于较难破壁的革兰氏阳性菌,需加入溶菌酶消化细胞壁后,再进行基因组DNA的提取。具体方法为:向步骤1收集到的菌体中,加入180 μl 缓冲液(20 mM Tris, pH8.0,

2 mM EDTA,1.2% Triton100)和终浓度为20 mg/ml的溶菌酶(东盛货号:N9021),振荡混匀。37℃处理30min以上。

 如需要去除RNA,加完消化缓冲液DS或溶菌酶后,加入4 μl RNase A(100 mg/ml)溶液,震荡混匀,室温放置5min。

 3  加入20 μl蛋白酶K溶液,混匀。

 4  加入220 μl裂解液MS,漩涡振荡混匀,直至形成均一的悬浮液。65℃温浴10min。溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠。

  注:加入裂解液MS时可能会产生白色沉淀,一般65℃放置时会消失,不会影响后续实验。如溶液未变清亮,说明细菌细胞裂解不彻底,可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。    

  如菌体超过1.5 ml,可适当延长温浴时间。

5  加入220 μl无水乙醇,上下颠倒混匀。此时可能出现絮状沉淀,将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中。12,000 rpm离心1min,弃滤液。

  注:此时基因组DNA被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上。

 如柱子堵塞表明菌体过量。若发生此情况,减少菌量,或适当延长离心时间,直至洗脱液顺利离心至离心管为止。

6   加入500 μl去蛋白液PS。12,000 rpm离心1min,弃滤液。

   注:此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、脂质等杂质洗脱,以获得高质量基因组DNA。

7   加入500μl漂洗液PE。12,000 rpm离心1min,弃滤液。

   注:漂洗液PE初次使用前用无水乙醇按1: 3稀释,即含75%乙醇。

8   加入500μl漂洗液PE。12,000 rpm离心1min,弃滤液。

9   12,000 rpm离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体。

   注:此步骤的作用是去除残留乙醇,避免影响后续的酶促反应(PCR或酶切)。同时利于基因组DNA充分溶解。

10 将纯化柱置于新的1.5 ml离心管中。向纯化柱中央处,悬空加入30-100μl洗脱液TE。室温放置2min。于12,000 rpm离心2min,管底即为高纯度基因组DNA。-20保存。

注:洗脱液TE可用去离子水代替,但其pH需为8.0-8.5。体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。

对洗脱液TE 60℃预热,会提高基因组DNA的产量。

图2  细菌基因组DNA电泳图

 

注意事项

1  应尽量使用新鲜的菌体,确保提取的基因组DNA不被降解。

2  在操作步骤4中,菌体应充分悬浮,不要残留菌块,避免影响溶菌效果。

3  在操作步骤5种,加入无水乙醇后,可能会出现絮状沉淀,应将离心管内的溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中,确保基因组DNA的得率。

4  基因组DNA需长期保存时,建议使用纯化液TE。分装后保存于-20℃或-80℃。

5  基因组DNA 浓度及纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。

基因组DNA的浓度及纯度检测

1  基因组DNA 片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。

2  DNA 应在OD260 处有显著吸收峰, OD260 值为1 相当于大约50μg/ml 双链DNA、40 μg/ml 单链DNA。

3  OD260/280比值应为1.7–1.9,如果洗脱时不使用纯化液TE,而使用去离子水,比值会偏低,因为pH 值和离子存在会影响光吸收值,但并不表示纯度低。

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