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高纯度质粒小提试剂盒
高纯度质粒小提试剂盒
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国产/进口:国产半年访问:26
产地/品牌:东盛产品类别:分子生物学试剂
规       格:50次/100次/200次最后更新:2018-7-31
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参考报价:210/345/645
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货号

规格

价格

N1011

50次

210

N1012

100次

345

N1013

200次

645

产品组分

组分

货号

N1011

N1012

N1013

RNaseA(10 mg/ml)

150 μl

300 μl

600 μl

溶液Ⅰ

15 ml

30 ml

60 ml

溶液Ⅱ

15 ml

30 ml

60 ml

溶液Ⅲ

20 ml

40 ml

80 ml

溶液PB

30 ml

60 ml

120 ml

溶液W

30 ml

30 ml×2

40 ml×3

溶液Eluent

5 ml

10 ml

20 ml

DNA纯化柱

 50个

 100个

 200个

说明书

1份

1份

1份

注:溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释,即含60%乙醇。

溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液PB中含有碱及蛋白变性剂,请不要直接接触皮肤。

上述产品组分均可单独购买,详见产品索引。

保存条件

RNase A:-室温保存。RNase A为浑浊溶液。初次使用本试剂盒时,请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中,均匀混合后于4℃保存。可保存6个月。

其他试剂:室温保存。

若溶液Ⅱ出现沉淀,请于37℃保温溶解。待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

产品说明

本产品采用了经典的硅胶膜及碱裂法技术,可用于质粒DNA的小量纯化。其纯化原理是碱裂解细菌后,硅胶膜柱高效可逆地吸附体系中的质粒DNA(高盐、低pH值),同时去除蛋白及其它杂质,被吸附的DNA在低盐、高pH值条件下再被洗脱纯化出来。一次可从1-5 ml过夜培养的菌液中提取10-40 μg高拷贝质粒DNA(OD260/OD280 = 1.7-1.9),此质粒DNA可直接用于DNA序列分析以及各种酶促反应等。

产品特点

  • 高效:一次可获得10-40 μg高拷贝质粒DNA。
  • 高纯度:OD260/OD280=1.7-1.9。无须经酚/氯仿抽提纯化,可直接使用。
  • 快速:30min完成实验。

产品用途

  • 常规限制性酶切
  • PCR扩增转化
  • DNA序列测定
  • 体外转录

质量控制

从大肠杆菌提取pGEM质粒DNA。提取的质粒DNA质量通过琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切和序列测定分析。

质粒DNA提取流程图

图1  质粒DNA纯化流程图

操作方法

1  用1.5 ml离心管收集1-5 ml菌液。12,000 rpm离心1min,弃上清。

    注:应根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数,确定收集的菌液量。菌量过大可能导致溶菌不充分,纯化时会影响质粒纯度。菌体的体积与质粒拷贝数参见注意事项。

2  加入250 µl溶液Ⅰ/RNase A混合液,漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置1-2min。

    注:初次使用本试剂盒时,请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中,均匀混合后于4℃保存。可保存6个月。

    不要残留细小菌块。菌体悬浮充分与否将决定质粒DNA得率的高低。

    室温静置1-2min是为使溶液中的RNA被充分降解。

3  加入250 µl溶液Ⅱ,轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min,使菌体充分裂解,直至形成澄清的裂解溶液。

    注:若溶液Ⅱ出现沉淀,请于37℃保温溶解。待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

        不可剧烈混和,否则会使染色体DNA断裂。

        此步骤不宜超过5min。

4  加入350 µl溶液Ⅲ,立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。

5  12,000 rpm室温离心10min,收集上清。

6  将上清置于DNA纯化柱中,静置1-2min。

   注:如果收集的上清液过多,超过DNA纯化柱容积(800 μl),可将上清分次加入DNA纯化柱中。

7  12,000 rpm 离心1min,弃滤液。

    注:此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱的硅胶膜上。

8  加入500 µl 溶液PB,12,000 rpm 离心1min,弃滤液。

    注:此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱,以获得高质量质粒DNA。

9  加入500 µl溶液W,12,000 rpm 离心1min,弃滤液。

   注:溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释,即含60%乙醇。

10加入500 µl溶液W,12,000 rpm 离心1min,弃滤液。

11 12,000 rpm离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体。

12 将DNA纯化柱置于新的离心管中。向纯化柱中央处,悬空滴加50-100 µl溶液Eluent,室温放置2min。12,000 rpm离心1min,管底即为高纯度质粒

DNA。质粒DNA于-20℃保存

   注:溶液Eluent可用无菌双蒸水代替,但其pH需为8.0-8.5。溶液Eluent的加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。对溶液Eluent 60℃预热,会提高提取质粒的

产量。

图2  质粒DNA电泳图

注意事项

1  本产品适用于革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌中的质粒DNA提取。由于革兰氏阳性菌外被一层较厚的细胞壁,会严重影响碱裂解细菌细胞的效率。因此,必须在碱裂解细胞前

用溶菌酶消化细胞壁(货号)。处理方法为:离心收集适量菌体,弃上清,加入250 μl溶液Ⅰ,充分振荡悬浮菌体。加入溶菌酶使其终浓度为10-20 mg/ml左右,37处理30min。

溶菌酶的浓度和处理时间可根据菌株的不同与具体的实验条件加以调整。

2  提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如为高拷贝质粒,建议使用2 ml菌液,可提取10-15 μg质粒。低拷贝质粒或大于10 kb质粒,建议使用5-10 ml菌液(按

照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ 的用量),可提取4-6μg质粒。溶液Eluent 应在60℃水浴预热,在吸附和洗脱时可以适当的延长时间,以增加提取效率。其它步骤相同。

3  所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心,速度为12,000 rpm(约13,400×g)。

4 溶液 Eluent(10 mM Tris-HCl, pH 8.5)中不含EDTA,其收集的DNA片段可直接用于各种酶促反应等,不会影响后续试验。

5 为了保证回收效率,请不要使用未调整pH值的超纯水洗脱目的片段。

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